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文昌市规划建设管理局网站,儿童创意产品设计,科技型中小企业服务平台,苏宁网站优化与推广α-Bungarotoxin, AF680 #xff0c;α-眼镜蛇毒素-荧光素680标记物#xff0c;反应原理一、α-Bungarotoxin, AF680的中文名称α-Bungarotoxin, AF680 在中文文献中通常称为#xff1a;“α-眼镜蛇毒素-荧光素680标记物”其中#xff1a;α-Bungarotoxin#xff08;α…α-Bungarotoxin, AF680 α-眼镜蛇毒素-荧光素680标记物反应原理一、α-Bungarotoxin, AF680的中文名称α-Bungarotoxin, AF680 在中文文献中通常称为“α-眼镜蛇毒素-荧光素680标记物”其中α-Bungarotoxinα-眼镜蛇毒素源自东亚眼镜蛇Bungarus multicinctus毒液的多肽毒素约74个氨基酸分子量约8 kDa具有三指结构three-finger toxin能够高度特异性结合神经肌肉接头的尼古丁型乙酰胆碱受体nAChRα1亚单位。AF680Alexa Fluor 680近红外荧光染料激发波长约680 nm发射波长约700 nm具有高亮度、光稳定性强、适合深组织成像的特性。因此α-Bungarotoxin, AF680 是 α-眼镜蛇毒素与AF680荧光染料共价偶联的产物兼具高亲和力结合能力和近红外可视化功能。二、化学偶联反应原理α-Bungarotoxin 与 AF680 的标记反应通常通过 NHS酯化反应 实现。其反应原理如下活化染料AF680通常以NHS酯形式提供末端活性羧酸通过NHS活化形成高反应性的NHS酯。NHS酯在水相或缓冲液中与含氨基的分子发生亲核取代反应。与蛋白质偶联α-Bungarotoxin 蛋白质含有多个赖氨酸Lys残基的自由氨基。NHS酯在适宜的pH条件下pH 7.2–8.5与赖氨酸氨基反应形成稳定酰胺键。反应完成后AF680共价连接至蛋白质形成荧光标记的α-Bungarotoxin。反应特点选择性高NHS酯主要与蛋白质的自由氨基结合偶联特异性强。反应温和避免高温或极端pH环境可保持蛋白质的生物活性。可控性强通过调整染料与蛋白摩尔比可控制荧光标记度DOL, degree of labeling兼顾信号强度与生物活性。三、反应条件详述1. 缓冲液条件推荐缓冲液磷酸盐缓冲液PBS或碳酸盐缓冲液pH 7.2–8.5。注意事项避免使用含胺的缓冲液如Tris因为其氨基会与NHS酯竞争反应。缓冲液应无强还原剂如DTT或β-巯基乙醇以防破坏二硫键或与NHS酯副反应。2. 温度条件通常在 室温20–25°C 或 4°C 下进行反应温和保持蛋白质活性。高温可能导致蛋白质构象改变或降解降低结合活性。3. 摩尔比与反应时间染料与蛋白摩尔比常用3–10倍染料过量以保证充分标记但不破坏蛋白活性。反应时间通常 30 分钟至 2 小时根据标记程度和蛋白浓度调整。可通过小样品分析如吸光度测定或HPLC确认荧光标记度。4. 反应后处理去除未反应染料通过透析、凝胶过滤Sephadex G-25/G-50或超滤柱去除自由染料。缓冲液置换将标记产物转入适合保存和实验使用的缓冲液如PBS, pH 7.4。保存条件4°C避光保存短期可稳定数周长期可冻存-20°C至-80°C并加保护剂如甘油。四、关键实验参数及优化pH控制pH偏低7会降低NHS酯活性反应效率降低。pH偏高9可能加速蛋白质非特异性降解或侧反应。最适pH 7.4–8.0可兼顾蛋白稳定性和偶联效率。蛋白浓度适中浓度1–5 mg/mL可保证反应充分且便于后续纯化。过稀会导致反应效率降低过浓可能形成非特异性聚集。标记度控制DOL标记过多可能影响α-Bungarotoxin与nAChR的结合活性。通过调整染料过量倍数和反应时间可实现理想荧光信号与生物活性的平衡。溶剂条件AF680 NHS酯通常溶于DMSO或DMF加入缓冲液时应确保有机溶剂体积分数不超过5–10%以防蛋白质变性。光保护AF680为光敏性染料反应和纯化过程中应避光操作减少荧光漂白。五、应用场景与优势神经肌肉接头标记α-Bungarotoxin, AF680 可特异性结合肌肉nAChR α1亚单位。通过近红外荧光信号观察受体分布和动态变化。体内成像AF680发射近红外光可减少组织自发荧光干扰适合深组织非侵入式成像。可用于小动物模型的神经肌肉接头成像或药物干预效果监测。受体结合与药物筛选可作为高亲和力受体探针检测药物对nAChR的占用率或竞争性结合。结合荧光定量分析实现受体密度和分布研究。优势| 特点 | 优势 ||------|------|| 高亲和力 | α-Bungarotoxin特异结合nAChR α1亚单位 || 近红外荧光 | AF680可在深组织成像降低自发荧光干扰 || 温和条件标记 | NHS酯反应温和蛋白活性保持良好 || 可控标记度 | 调节DOL实现荧光强度与生物活性的平衡 |六、总结α-Bungarotoxin, AF680 是一种 荧光标记α-眼镜蛇毒素具有如下特点高亲和力结合专一性结合nAChR α1亚单位。近红外荧光标记AF680提供可视化能力适合体内和体外成像。化学反应条件温和NHS酯化偶联在pH 7.4–8.0、室温条件下进行无铜催化保持蛋白活性。可控荧光标记度通过调整摩尔比、反应时间和温度实现荧光强度与生物活性平衡。实验应用广泛神经肌肉接头成像、受体分布分析、药物筛选及动物体内成像。通过严格控制 缓冲液pH、蛋白浓度、反应温度和时间可以获得高特异性、高荧光信号且保持蛋白质生物活性的α-Bungarotoxin, AF680 标记产物为神经科学和药物研究提供可靠工具。